上海有机所等解析首个Piezo复合物三维结构

Piezo家族离子通道感知机械力环境变化，将机械力信号转化为下游电化学信号，介导多种重要的生理活动，包括触觉、痛觉的感知、淋巴管发育、血压调节、神经轴突再生等。它的功能的异常会导致触觉超敏痛、淋巴管发育不良、神经退行性疾病等。而围绕Piezo家族蛋白功能机制的研究，仍存在诸多未解之谜。例如，Piezo蛋白自身能够感知和传递机械力信号，但研究发现与异源表达的Piezo蛋白相比，在很多细胞系中内源表达的Piezo表现出慢失活的门控特性（slow inactivation）。这种门控特性差异产生的原因和生理意义尚不清楚，研究推测与蛋白的相互作用或膜局部的磷脂组成等有关。由于许多离子通道都存在与之相结合的附属亚基来调控其亚细胞定位和门控特性，科研人员致力于寻找能够调控Piezo蛋白功能的附属亚基。附属亚基的定义通常为自身并不参与离子孔道形成 、与孔道蛋白有直接和稳定的相互作用、在异源表达系统中能够调控通道特性、在内源细胞中能够调控通道门控特性。尽管科学家做出了努力，但目前尚未发现能够满足以上四个标准的Piezo附属亚基，阻碍了对Piezo蛋白不同门控特性分子机制的研究。

8月18日，澳大利亚Victor Chang心脏研究所Charles Cox课题组与中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心张一小课题组，在《科学》（Science）上，发表了题为《MyoD家族抑制蛋白作为Piezo通道的辅助亚基》（MyoD-family inhibitor proteins act as auxiliary subunits of Piezo channels）的研究文章。该研究首次报道了MyoD家族抑制蛋白MDFIC和MDFI是Piezo1/2的结合蛋白，通过结构解析和功能研究发现MDFIC通过C末端一段高度脂质化修饰的两亲性α螺旋从侧面插向Piezo的孔道模块，并证实该α螺旋能够引起外源和内源Piezo1/2的慢失活过程。该研究鉴定了首个Piezo蛋白附属亚基，解释了在许多细胞类型中观察到的内源Piezo通道截然不同的门控特性，为Piezo通道功能机制的研究提供了全新方向。

本研究利用CRISPR/Cas9编辑人真皮成纤维细胞 (hDF) 中的Piezo1（在多种组织来源的成纤维细胞中Piezo1表现出较慢的失活特性）, 通过三种不同的策略来鉴定Piezo1结合蛋白。研究经过严格的质谱数据分析，确定三组中均存在但在各自的阴性对照中不存在的Piezo1相互作用蛋白。研究仅鉴定出两种蛋白质——第一种是Piezo1，第二种是研究较少的转录调节因子MDFIC（图1）。研究通过免疫共沉淀在HEK293T细胞中验证了MDFIC与Piezo1/2之间的相互作用。

为探究MDFIC与Piezo的相互作用模式，科研人员利用冷冻电镜单颗粒三维重构，解析了Piezo1-MDFIC复合物的高分辨率三维结构，发现了MDFIC通过C末端一段富含半胱氨酸的两亲性α螺旋从侧面插向Piezo的孔道模块。该α螺旋横躺于磷脂双分子层内侧，与Piezo蛋白的多个氨基酸存在相互作用。研究显示，在Piezo与MDFIC上均有能够引起淋巴系统发育异常的突变位于该相互作用界面上，提示了Piezo-MDIFC复合物在功能上的重要性（图2）。

由于MDFIC结合在Piezo的孔道模块，研究推测MDFIC可能会调控Piezo的门控特性。通过全细胞膜片钳，研究证实MDFIC和MDFI能够显著引起Piezo1/2通道的慢失活门控特性。该门控特性是由与Piezo相互作用的最C末端的两亲性α螺旋所介导，缺失该α螺旋的MDFIC则不能引起Piezo的慢失活。同时，研究验证了该α螺旋对于内源Piezo的慢失活同样重要（图3）。

进一步，研究初步探讨了MDIFC引起Piezo慢失活的分子机制。由于在Piezo1-MDFIC复合物冷冻电镜密度中，位于细胞膜一侧的5个半胱氨酸上均具有多余的密度，研究推测其为脂质化修饰。通过酰基生物素交换实验，研究证实MDFIC的C末端存在棕榈酰化修饰。科研人员研究了MDFIC脂质化修饰对Piezo门控特性的影响。研究将5个Cys突变为5个Ala或者5个Ser之后，缺少脂质化修饰的MDFIC仍能够与Piezo相结合，但无法引起Piezo的慢失活，提示MDFIC的脂质化修饰对于Piezo的门控特性具有重要的调节作用。通过分子动力学模拟，研究发现MDFIC上的脂质化修饰能够与在Piezo失活过程中起到关键作用的L2475相互作用，可能介导了MDFIC对于Piezo蛋白的调控（图4）。

综上，本文鉴定了首个Piezo蛋白附属亚基MDFIC，通过结构解析和功能研究，揭示了MDFIC介导Piezo慢失活的分子机制。研究工作得到科技部科技创新2030-“脑科学与类脑研究”重大项目、国家自然科学基金、中国科学院上海分院青年英才培育计划、上海脑科学与类脑研究中心“求索杰出青年”计划和上海市科学技术委员会等的支持。

论文链接

图1. 亲和捕获质谱鉴定MDFIC是Piezo结合蛋白

图2. Piezo1-MDFIC冷冻电镜三维结构

图3. MDFIC/MDFI调控Piezo蛋白的门控特性

图4. MDFIC的脂质化修饰参与Piezo门控调节